Tamizado

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN DE WILLIS

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN DE WILLIS

Objetivo:

Realizar método de concentración por flotación simple.

Introducción:

Las técnicas de flotación permiten la separación de quistes de protozoos y huevos de ciertos helmintos del exceso de residuos mediante el uso de soluciones con elevada gravedad específica. Los elementos parasitarios son recuperados de la capa superficial y los residuos se mantienen en el fondo del tubo. Con estas técnicas los preparados son más limpios que los obtenidos por sedimentación. Sin embargo, algunos huevos (como los opérculados, o los densos como los estériles de Ascaris lumbricoides) no se concentran bien en las flotaciones; en estos casos se recomienda el uso de técnicas de sedimentación. De todas maneras, en las flotaciones se observa también el fondo del tubo para asegurar la recuperación de todos los posibles organismos. Con el fin de maximizar la eficacia en la detección de parásitos intestinales se recomienda el uso de ambos métodos diagnósticos de manera conjunta.

Frecuencia de recuperación de helmintos y protozoos mediante dos técnicas de flotación.

Fundamento:

Este método esta recomendado especialmente para la investigación de protozoarios y helmintos. Consiste en preparar la materia fecal con solución saturada de cloruro de sodio (NaCl).

Los huevos y los quistes de peso específico menor que la solución saturada de cloruro de sodio tienden a subir y adherirse a un cubreobjetos colocado en contacto con la superficie del líquido.

Material:

· Vaso de precipitados

· Embudo

· Gasa

· Tubo de ensaye

· Portaobjetos

· Cubreobjetos

· Abate lenguas

Reactivos

· Solución saturada de cloruro de sodio (NaCl)

·Solución de yodo-lugol

Muestra 

· Muestra de heces fecales

Procedimiento 

Tomar aproximadamente 1gr. De heces con un abate lenguas.

Colocar la muestra en un vaso de precipitados y mezclar con 10ml de solución saturada de cloruro de sodio.

En un tubo de ensaye filtre la mezcla con una gasa, llenando completamente el tubo.

Coloque un cubreobjetos sobre el tubo, de tal manera que el liquido haga contacto con el cubreobjetos.

 

5)    Esperar de 5 a 10 minutos.

6)    Los quistes o huevos flotaran y quedaran adheridos a la cara del cubreobjetos que esta en contacto con la mezcla de heces y cloruro de sodio saturado.

Colocar una gota de yodo-lugol sobre un portaobjeto, retirar el cubreobjetos con cuidado para evitar perdida del material y ponerlo sobre el portaobjetos.

8)   Examinar la muestra al microscopio con el objetivo de 40X, buscando quistes o huevecillos.   

  

Resultados:

               HECES FECALES 40X:

Encontramos un quiste de Entamoeba histolytica y fibras musculares.

Entamoeba histolytica

 Parasito común en el intestino grueso de los humanos. Muchos casos son asintomáticos excepto en humanos que viven bajo estrés. Esta se transmite a través de las excretas de personas infectadas, a través del agua o alimentos contaminados estos se presentan en quistes y después se pueden presentar en trofozoítos.

El método de Ritchie

OBJETIVO

Aprender a realizar la técnica por sedimentación de Ritchie, para la búsqueda de quistes y huevos que puedan quedar sedimentados.

FUNDAMENTO

Existen dos procedimientos principales en las heces para su análisis: flotación y sedimentación.

La sedimentación es menos eficaz que la flotación para la concentración de quistes de protozoarios y abundantes huevos, pero es más útil para la búsqueda de huevos de esquistosoma y operculados.

El método de Ritchie o también llamado método de concentración en éter-formalina es una técnica de sedimentación que se basa en la concentración de huevos de helmintos, larvas y quistes de protozoarios mediante la centrifugación, con la ayuda de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios.

Entre las muchas ventajas que tiene este procedimiento están: 
1. Reune  y no deforma las posibles formas parasitarias
2. Permite que se pueda transportar y almacenar la materia fecal procesada antes de ser examinada, pues los agentes quimicos conservan a los parasitos que existan en la muestra
3. Se usa cuando necesitan una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

    

MATERIAL: v  Tubos de ensaye cónicos de 15 ml v  Embudo de cristal v  Vaso de precipitados 50 ml v  Gasa cortada en cuadro v  Aplicadores de madera v  Abatelenguas v  Pipetas Pasteur con bulbo v  Portaobjetos v  Cubreobjetos v  Gradilla v  Centrifuga v  Microscopio                                                                SUSTANCIAS: Ø  Solución salina isotónica Ø  Solución de formaldehído al 10% Ø  Éter etílico Ø  Solución de yodo-lugol Ø  Muestra biológica: heces fecales frescas PROCEDIMIENTO 1.    Tomar con el abatelenguas aproximadamente 1 gr de materia fecal y colocar en el vaso de precipitados, añadir 10 ml de solución salina y homogeneizar  2.    Se filtra la suspensión a través de la gasa doblada en cuatro partes y colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.       3.    Centrifugar el filtrado a 2000 rpm por 2 minutos  4.    Decantar el líquido sobrenadante y resuspender con el aplicador de madera el sedimento con solución salina. Centrifugar nuevamente, decantar y resuspender dos veces más. 5.    Al último sedimento se agregan 5 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos en la gradilla 6.    Se añaden 0.5 ml de éter, se tapan los tubos y se agitan enérgicamente durante 30 segundos. 7.    Centrifugar durante 2 minutos a 2000 rpm 8.    Después de centrifugar se observan cuatro capas (se hablara de ellas mas adelante) 9.    Decantar el sobrenadante 10. Introducir la pipeta Pasteur hasta el sedimento, extraer con cuidado una gota del sedimento y colocarla en el portaobjetos 11. Añadir una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos homogeneizar, y cubrir con el mismo 12. Observar la preparación con al microscopio con objetivos. Se distinguen en esta de imágenes muchos restos vegetales, grasas y algunos quistes disperso..

Metodo de Faust #2

METODO DE CONCENTRACION FLOTACION DE FAUST

La técnica de Faust, hace una buena concentración de quistes, huevos y larvas; es la técnica preferida por la generalidad de los laboratorios. Las formas parasitarias son encontradas con facilidad pues las preparaciones quedan con pocos artefactos. Los elementos parasitarios son recuperados de la capa superficial y los residuos se mantienen en el fondo del tubo. Con estas técnicas los preparados son más limpios que los obtenidos por sedimentación.

La frecuencia de las distintas parasitosis es alta, sobre todo en países en vías de desarrollo; es importante por ello que los laboratorios clínicos manejen de forma rutinaria varios métodos coproparasitoscópicos alternativos que apoyen el diagnóstico parasitológico.

MATERIAL

·         Porta objetos.

·         Cubreobjetos.

·         Gasas.

·         Tubos de ensayo.

·         Solución acuosa de sulfato de Zn.

Muestras biológicas

·         Heces

TECNICA

1) Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una superficie en 10 partes de agua destilada.

2) Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrifuga, ayudándose con un embudo pequeño.

3) Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1min.

4) Decantar el liquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Re suspender el sedimento.

5) Repetir el procedimiento hasta 2 veces hasta que el liquido sobrenadante este listo.

6) Decantar nuevamente el líquido sobrenadante remplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zn al 33%. Mezclar bien la solución bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 minutos por 1500 rpm.

7) Tomar de 3-4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del liquido. Colocarlos en un porta-objeto y mezclar con 1-2 gotas de lugol, colocar cubre-objeto

8) Examinar al microscopio y reporte sus resultados.

NOTA:Lo que encontramos en la muestra fue E.Coli. y grasa.

PRACTICA # 3 " METODO C.P.S DIRECTO O EN FRESCO"

“METODO C.P.S DIRECTO O EN FRESCO”

     

INTRODUCCION

Como sabemos uno de los primeros microscopistas fue Antón Van Leewenhoek y a mediados del siglo XVII fue el primero en utilizar este método al observar directamente en sus propias heces fecales, trofozoitos de Giardia lamblia.

El método que necesita menos equipo y el más sencillo de realizar, corresponde a las preparaciones húmedas, que se hacen directamente con muestras de heces. Para las preparaciones directas de heces frescas o no preservadas, los exámenes ordinarios se hacen con solución salina isotónica y lugol. Si se emplean heces preservadas, el formol sirve de diluyente.

Las preparaciones no teñidas son de especial valor para el estudio de parásitos vivos, como trofozoitos  de protozoarios móviles, huevos de helmintos y larvas de nematodos. El lugol se emplea principalmente para la búsqueda e identificación de quistes y larvas, con base a sus características.

La mezcla normal en el tracto intestinal por lo general no asegura distribución uniforme de trofozoitos de protozoarios móviles, huevos de helmintos y larvas de nematodos. Sin embargo el examen de materia fecal directo o en fresco puede revelar  o no parásitos, dependiendo de la intensidad de la infección.

    

FUNDAMENTO

La solución salina isotónica da las condiciones adecuadas para que la celula se mantenga viva. El medio ideal para todo tipo de parasito que pueda encontrarse en las muestras de heces, en cualquier etapa de desarrollo, es la solución salina fisiológica, y el lugol en la práctica ha demostrado su eficacia para la tinción e identificación de parásitos intestinales.

MATERIAL

·         Muestra fecal

·         Aplicadores de madera

·         Portaobjetos de 25 x 76 mm

·         Cubreobjetos

·         Solución salina isotónica

·         Lugol parasitológico

En esta ocasión utilizamos3 muestras para y realizamos el mismo procedimiento

TECNICA

·         En un portaobjetos colocar una gota de solución salina isotónica

o   Con la punta del aplicador tomar una pequeña muestra de aproximadamente 1 a 4 mg de heces, en muestras con moco y sangre elegir esta parte para estudiar.

o   Mezclar, procurando hacer una suspensión en preparación delgada y no un frotis.

o   Quitar de la suspensión fibras y otros fragmentos grandes.

o   Colocar el cubreobjetos lentamente procurando no dejar burbujas.

Repetir la operación con una gota de lugol en lugar de la solución salina.

o   En un portaobjetos colocar una gota de  lugol

o   Con la punta del aplicador tomar una pequeña muestra de aproximadamente 1 a 4 mg de heces, en muestras con moco y sangre elegir esta parte para estudiar.

o   Mezclar, procurando hacer una suspensión en preparación delgada y no un frotis.

o   Quitar de la suspensión fibras y otros fragmentos grandes.

o   Colocar el cubreobjetos lentamente procurando no dejar burbujas.  

o   Examinar en microscopio en forma sistemática a seco débil y a seco fuerte.

NOTA: En ambos procedimientos se tienen que quemar los aplicadores de madera para esterilizarlos, así como inactivar las muestras una vez concluidos los procedimientos adecuados.

Forma de reportar

Primero se escribe la fase o estudio y enseguida el nombre del parasito con el genérico indicado con mayúscula  y el especifico con minúscula, subrayando o escribiéndolo con otro tipo de letra.

Por ejemplo

Huecos de Ascaris lumnricoides.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS.

A) Ventajas

-la sencillez y rapidez para llevar a cabo este método, además de la economía en su realización.

-Esta técnica es la más útil para encontrar  tronfozitos de amibas y flagelados.

-Permite observar la movilidad de los organismos, la cual con mucha frecuencia es  característica y sirve para hacer identificación exacta.

B) Desventajas.

-La preparación con lugol puede destruir las formas sensibles como los tronfozitos.

-la muestra utilizada es tan pequeña que es poco representativa.

AUTOEVALUACION:

¿Qué es la solución salina isotónica?

sirve para poner a los parásitos en el portaobjetos en donde se mirara al microscopio. Esta solución mantiene viables a los organismos por que no rompen sus membranas ni los llena de agua, por lo que los puedes ver en fresco, es decir, como son normalmente.

OBSERVACIONES

Haga esquemas de sus observaciones anotando lo siguiente.

A) Género y especie del paracito.

B) Estado vital.

C) Aumento utilizado. 10x, 40x

D) Estructuras observadas.

E)  Género y especie del paracito.

F) Estado vital

G) Aumento utilizado 10x 40 x

H) Estructuras observadas.

I)  Género y especie del paracito.

J) Estado vital

K) Aumento utilizado 10x, 40x

L) Estructuras observadas.

En esta ocasión el  Dr, Vicente nos proporcionó unas hojas con imágenes  de paracitos que podríamos encontrar en las muestras  y pudimos